ИСТОРИЯ
Исторически лаборатория механизмов регуляции иммунитета образовалась из группы ученых, руководимой Борисом Давидовичем Брондзом в составе лаборатории Л. А. Зильбера в НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н. Ф. Гамалеи. С 1977 по 1989 год группа работает в составе лаборатории иммунохимии Онкологического Научного Центра РАМН под руководством профессора Г. И. Абелева. В 1989 г. лаборатория стала самостоятельным подразделением в составе НИИ канцерогенеза.
Центральным направлением исследований руководителя группы и возглавляемых им сотрудников стало выяснение механизмов распознавания молекул гистосовместимости клетками иммунной системы. Во второй половине XX века в результате синтеза иммунологии опухолей, трансплантологии, генетики и биохимии родилась клеточная иммунология - дисциплина, направленная на исследование механизмов специфического распознавания антигенов клетками иммунной системы. Была показана реальность специфического иммунного ответа на антигены опухолей и впоследствии - центральная роль в этом процессе Т-клеток - малых лимфоцитов, происходящих в онтогенезе из тимуса. Дальнейшее развитие клеточной иммунологии привело к осознанию того факта, что специфические антигенсвязывающие рецепторы Т-лимфоцитов распознают антигены бактерий, вирусов и опухолей в виде коротких пептидов, связанных с молекулами гистосовместимости и представленных на поверхности клеток организма. Антигены опухолей и вирусов подвергаются процессингу внутри клетки, связываются с молекулами гистосовместимости и b2-микроглобулином в ЭПР и в виде тройного комплекса встраиваются в мембрану клетки. Специфические рецепторы Т-лимфоцитов распознают паттерн, образованный в этом комплексе аминокислотными остатками как антигенного пептида, так и тяжелой цепи молекулы гистосовместимости. Такой механизм распознавания дает возможность иммунной системе “заглянуть” внутрь клетки и выявить наличие в ней чужеродных или мутантных белков. По этой причине исследования в области специфического трансплантационного, противовирусного и противоопухолевого иммунитета всегда были тесно взаимосвязаны и взаимно дополняли друг друга. Открытие функциональной неоднородности Т-клеток, рецепторы которых взаимодействуют с различными формами молекул MHC в свое время определили предмет исследований нашей лаборатории - изучение специфичности и условий антигензависимой дифференцировки различных функциональных субклассов Т-лимфоцитов, механизмов их взаимодействия с молекулами MHC и принципов их регуляторных взаимодействий друг с другом.
РАЗВИТИЕ
Механизмы взаимодействия молекул MHC с рецепторами Т-лимфоцитов (TCR) лежат в основе трех тесно взаимосвязанных проблем современной медицины: эффективной иммунотерапии опухолей, лечения аутоиммунных заболеваний и клинической трансплантации органов и тканей. Все эти проблемы основаны на способности иммунной системы отличать "свое" от "чужого". У Т-лимфоцитов эта способность формируется в процессе селекции в тимусе благодаря тому, что они в процессе своего развития проходят стадию высокой чувствительности к сигналам, поступающим от взаимодействия их Т-клеточных рецепторов с молекулами MHC тимуса. Если TCR развивающегося Т-лимфоцита способен к сильному высокоаффинному взаимодействию со "своими" молекулами MHC, то полученный им антигенспецифический сигнал приводит к гибели такого Т-лимфоцита. Эта закономерность лежит в основе формирования центральной толерантности иммунной системы к собственным органам и тканям и объясняет, почему иммунная система не разрушает организм, в котором она сформировалась. Недавно обнаружено, что в медуллярном эпителии тимуса имеет место экспрессия широчайшего спектра стадиоспецифических и органоспецифических антигенов, которая регулируется геном AIRE (аутоиммунный регулятор). У животных-нокаутов по этому гену развиваются аутоиммунные полиэндокринопатии. Для иммунологии опухолей особенно важно, что в числе молекул, экспрессирующихся в тимусе, присутствуют и опухолеассоциированные антигены (в том числе, антигены тестиса), являющиеся излюбленной мишенью создателей противоопухолевых вакцин [Derbinsky J., et al., 2001; Derbinsky J., et al., 2005]. Их экспрессия в клетках медуллярного эпителия тимуса делает иллюзорными надежды скорой разработки и получения противоопухолевых вакцин. Ключевое препятствие на пути к их созданию состоит в том, что иммунная система толерантна по отношению к этим антигенам и в организме отсутствуют Т-лимфоциты с высокоаффинными рецепторами, которые такие вакцины могли бы успешно стимулировать. Таким образом, проблема стимуляции противоопухолевого иммунитета является проблемой индукции "полезного" аутоиммунитета и путь к этой цели лежит через познание закономерностей внутритимусной селекции Т-лимфоцитов и разработку способов ею управлять. Одним из возможных подходов к преодолению толерантности к опухолеассоциированным антигенам, предложенным Гансом Стауссом, является молекулярное клонирование Т-клеточных рецепторов Т-лимфоцитов аллогенного донора. В силу того, что у аллогенного донора экспрессируются другие молекулы MHC, репертуар его Т-лимфоцитов сохраняет способность реагировать на молекулы MHC реципиента, в том числе и на те, которые презентируют молекулы опухолеассоциированных антигенов. Этот подход был успешно применен Гансом Стауссом и Еленой Садовниковой на моделях адоптивной иммунотерапии рака [Sadovnikova E., Stauss H.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1996, V. 93, N. 23, P. 13114-13118.]. Путем трансфекции рецепторов таких "аллорестриктированных" Т-клеток в Т-лимфоциты реципиента можно "заставить" его иммунную систему отвечать на антигены, к которым она в норме толерантна [Morris EC, et al., 2005; Xue S, et al., 2005]. Создание животных, экспрессирующих трансгенные Т-клеточные рецепторы, позволит сделать "видимыми" процессы внутритимусной селекции и научиться ими управлять. Такие модели трансгенной экспрессии Т-клеточных рецепторов могут быть использованы для поиска и создания нового поколения противоопухолевых вакцин, действующих на уровне внутритимусной селекции и способных предотвращать негативную селекцию клонов Т-клеток, направленных к антигенам опухолей. Ценность этого методического подхода заключается в том, что клонированные Т-клеточные рецепторы могут быть легко сохранены в рекомбинантной форме в виде плазмид, а информация об их первичной структуре может быть записана в виде простых текстовых файлов, что позволит быстро воспроизводить желаемые результаты в любой точке планеты, обладающей достаточной базой для проведения таких исследований.
Многочисленные исследования природы взаимодействий Т-клеточных рецепторов с молекулами MHC пока не сумели ответить на ключевой и фундаментальный вопрос - в чем причина избирательности их взаимодействия друг с другом? До 1997 г. этот вопрос перед иммунологами не стоял, поскольку предполагалось, что эта избирательность является следствием позитивной селекции в тимусе и выживания лишь тех Т-клеток, рецепторы которых способны взаимодействовать со "своими" молекулами MHC. В рамках этой гипотезы дальнейшие вариации функциональных последствий взаимодействия TCR с MHC определялись лишь природой пептида, связанного с молекулой гистосовместимости, а феномен аллореактивности трактовался как случайное проявление кросс-реактивности Т-клеточных рецепторов, "обученных" в тимусе распознаванию собственных молекул MHC организма. Но в 1997 году Йенс Церран, Вернер Хелд и Давид Руле установили, что способность Т-клеточных рецепторов к взаимодействию с молекулами MHC не формируется в процессе тимусной селекции, как полагали ранее, а присутствует в репертуаре исходно. Стимулируя искусственно антителами к TCRa/b и CD4 развитие Т-клеток в органных культурах эмбрионального тимуса мыши с нокаутированными генами MHC, они показали, что в образующемся репертуаре с высокой частотой встречаются Т-клетки, способные к взаимодействию с различными аллельными формами молекул MHC, хотя в процессе своего развития Т-клетки такого репертуара не имели возможности "увидеть" ни "свои" молекулы MHC ни "чужие" и, следовательно, "научиться" их распознавать. Определенные частоты таких клеток были сопоставимы с частотами аллореактивных клеток в репертуаре нормальных мышей, что позволило авторам заключить, что способность к взаимодействию с продуктами MHC присутствует у репертуара Т-клеток исходно, до прохождения процессов позитивной и негативной селекции в тимусе [Zerrahn J., Held W., Raulet D.H., Cell, 1997, V. 88. P. 627-636.]. Иными словами, аллореактивность является врожденным свойством репертуара Т-клеток. Впоследствии T.H.Yang и H.J.Stauss расширили этот вывод и на MHC-рестриктированное распознавание в целом [Yang T.H., et al., Int. Immunol., 2002, V. 14, N. 11, P. 1283-1290.]. По мнению автора этих строк такое врожденное предпочтение Т-клеточных рецепторов к распознаванию молекул MHC вида могло возникнуть в эволюции как средство эффективного формирования толерантности к "своему". Сегрегация потенциально разрушительного иммунного ответа на нескольких типах молекул (классических молекул MHC), презентирующих антигены в виде коротких пептидов, позволила "вывести из-под удара" иммунной системы функциональные конформационные эпитопы жизненно важных белков организма и избавило ее от необходимости формирования толерантности ко всему их разнообразию.
Врожденная способность к распознаванию Т-клетками молекул MHC с неизбежностью ставит вопрос о том, каковы структурные ограничения этого процесса. Распознавание молекул MHC рецепторами Т-клеток не имеет видовых ограничений - для него важно совпадение в видовой специфичности лишь акцессорных молекул (корецепторов, костимуляторных лигандов, цитокинов и их рецепторов), участвующих в иммунном ответе [Auchincloss H.Jr., Sachs D.H., 1998]. В результате анализа 275 аллельных форм, встречающихся у различных видов, нами было обнаружено, что инвариантные аминокислотные остатки присутствуют, главным образом, в областях контакта b-складчатых структур с a -спиралями, в "петлях" перехода b-слоев друг в друга, а также в a-спиральные структуры. Такое расположение говорит о том, что роль инвариантных остатков состоит в формировании внутримолекулярных взаимодействий, определяющих третичную структуру молекул MHC класса I. Обнаружение единого структурного мотива молекул MHC класса I в свою очередь позволило оценить сходство первичной структуры молекул MHC классов I и II, учитывая весь спектр аминокислотных замен, которые могут присутствовать в каждой позиции. Сопоставление гомологичных участков b -цепей молекул MHC класса II и a2-домена молекул MHC класса I привело к обнаружению фрагмента AA63-73 A
b-цепей и AA69-79 Eb-цепей, в котором имеет место высокая степень соответствия мотиву, выявленному в участке AA154-164 молекул MHC класса I. Такая "комбинаторная гомология" не является случайной, так как на пространственных моделях этих аллельных форм молекул MHC выявленный участок перекрывает область излома альфа-спиральной структуры (так называемый "kink region"), присутствующий в полипептидных цепях обоих типов молекул. Выявленный нами участок может формировать консервативный эпитоп, служащий своего рода "якорем", который позволяет Т-клеточному рецептору "увидеть", что перед ним - молекула MHC. Для проверки этого предположения мы использовали синтетические пептиды с последовательностью аминокислот тяжелой цепи молекул MHC класса I. Исследование их функций in vivo показало возможность индукции такими пептидами клеток с супрессорной функцией. Биологической активностью обладали пептиды с последовательностью областей контакта молекулы MHC с Т-клеточным рецептором. В виде мономеров такие пептиды способны вызывать апоптотическую гибель клеток цитолитических линий, специфичных к молекуле гистосовместимости, содержащей ту же последовательность аминокислотных остатков. Когда такие пептиды получили в древовидной форме в виде тетрамеров, они оказались способны вызывать выраженные иммунные ответы у животных и даже длительное время поддерживать жизнеспособность и пролиферацию Т-лимфоцитов в культуре in vitro. В такой измененной форме пептиды молекул MHC начинают стимулировать Т-лимфоциты и у животных, получивших инъекцию тетрамера усиливается иммунный ответ на другие антигены. Самой наглядной демонстрацией этого эффекта является двухкратное увеличение продолжительности жизни животных, получивших инъекцию летальной дозы клеток тимомы. Это увеличение сопровождается подавлением метастазирования клеток тимомы в периферические лимфатические узлы. Детальный анализ механизма иммуностимуляции показал, что способность синтезированных конструкций влиять на процессы внутритимусной селекции и дифференцировки Т-лимфоцитов является его существенным компонентом. В органных культурах эмбрионального тимуса пикомолярные концентрации препаратов вызывают усиление образования однопозитивных Т-клеток CD4+ и CD8+, экспрессирующих комплекс CD3/TCR, что свидетельствует об увеличении эффективности позитивной селекции Т-клеток в тимусе, и возможном расширении репертуара специфичностей Т-лимфоцитов. Таким образом, появилась реальная возможность для стимуляции иммунного ответа синтетическими конструкциями, имитирующими эпитопы молекул гистосовместимости. Такие конструкции вполне могут стать прообразом противовирусных и противоопухолевых вакцин будущего.Иммунный ответ на клетки аллогенных опухолей в эксперименте является одним из немногих примеров успешного распознавания опухолевых клеток иммунной системой хозяина и их последующего отторжения. Поэтому идентификация механизма распознавания и особенностей индукции иммунного ответа на молекулы главного комплекса гистосовместимости аллогенных опухолей способна дать важную информацию об этом типе иммунного ответа и его отличиях от иммунного ответа на аутологичные опухоли. Понимание механизмов, лежащих в основе его высокой эффективности, может быть важным для разработки новых подходов к иммунотерапии опухолей в клинике. В работах нашей лаборатории, проводившихся в течение ряда лет, впервые показано, что адаптивный иммунный ответ на клетки аллогенных опухолей выражается в высокоселективной экспансии Т-клеток CD8+. Роль профессиональных АПК реципиента в пролиферативном ответе клеток памяти CD8+ на аллоантигены опухолевых клеток пассивна и сводится к предоставлению спектра костимуляторных сигналов, необходимых для пролиферации Т-клеток. В первичном ответе на иммунизацию клетками аллогенных опухолей в селезенке реципиентов накапливается особая популяция нейтрофилоподобных клеток, экспрессирующих CD80, молекулы MHC класса II и IL-12. Эта реакция зависит от распознавания молекул MHC класса I Т-лимфоцитами CD8+ и имеет место у животных, с нокаутированными генами CD40 и CD4, что может свидетельствовать о ее независимости от дендритных клеток реципиента. Очевидно, она не является следствием ишемического повреждения, вызванного ростом опухоли, поскольку ее пик (на 6-7 день) наблюдается в тот момент, когда содержание опухолевых клеток в органе составляет лишь десятые доли процента. Она также не является следствием разрушения опухолевых клеток Т-лимфоцитами хозяина, поскольку наблюдается задолго до наступления пика активности антигенспецифических CTL (10-14 дней). Реальная функциональная роль нейтрофилоподобных клеток пока неясна, но первые полученные результаты позволяют предположить, что они играют важную роль в регуляции аллогенного ответа, супрессируя его, когда они находятся на стадии предшественников CD31+. Вполне вероятно, что зрелые дифференцированные клетки CD31- этого типа замещают костимуляторные сигналы дендритных клеток в индукции первичного ответа на аллогенные опухолевые клетки. Что особенно интересно, нейтрофилоподобные клетки появляются в первичном, но полностью отсутствуют во вторичном ответе на опухолевые клетки. Нами обнаружено, что адоптивный перенос клеток памяти CD8+ одновременно с иммунизацией клетками аллогенной опухоли существенно тормозит их появление в селезенке реципиента. Важное биологическое значение результатов этих исследований состоит в том, что в ответе на опухолевые клетки функция клеток врожденного иммунитета проявляется вторично по отношению к функциям клеток адаптивного иммунитета, что является важным отличием от иммунного ответе на инфекционные агенты.
Разработанный нами метод селективного тестирования клеток памяти CD8
+ по пролиферации в ответ на стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку, позволил обнаружить ряд интересных особенностей их биологии. Оказалось, что клетки памяти существенно подавляют ответы наивных Т-клеток на тот же антиген in vitro и in vivo. Демонстрация и исследование этого феномена стали возможными, когда мы использовали клетки мышей с трансгенной экспрессией GFP для адоптивного переноса. Это подавление имеет место в отсутствие значимой экспрессии IL-2 и сопровождается интенсивной продукцией IFNg и противовоспалительного цитокина IL-10. Селективная стимуляция клеток памяти аллогенными клетками, подвергнутыми острому тепловому шоку, позволило провести работы по клонированию Т-клеток памяти. С использованием этого методического подхода получен долгоживущий клон Т-клеток памяти CD8+, охарактеризована его специфичность, определен спектр продуцируемых цитокинов и первичная структура реаранжированных регионов цепей Т-клеточного рецептора. Этот же метод был с успехом использован для получения Т-гибридом из клеток памяти CD8+. Анализ их специфичности показал, что их реакция на иммунизирующий аллоантиген подавляется антителами к этому аллоантигену, но не к молекулам MHC класса I реципиента. Этот факт свидетельствует о прямом распознавании аллоантигена Т-клетками памяти и противоречит как гипотезе о непрямом примировании аллореактивных Т-клеток, так и их кросс-реактивности со "своим". С использованием реакции на стимуляторы мышей, нокаутированных по генам TAP и b2-микроглобулина, было обнаружено, что распознавание аллогенных молекул MHC клетками памяти CD8+ требует наличия интактных (не прошедших процессинга в дендритных клетках реципиента) аллогенных молекул MHC на поверхности стимуляторов, убитых острым тепловым шоком. Гены цепей Т-клеточного рецептора одной из таких гибридом были секвенированы, клонированы и трансфецированы в клетки тимомы 4G4 вместе с геном корецептора CD8. Полученные клетки приобрели способность отвечать продукцией IL-2 на стимуляторы дикого типа, экспрессирующие аллогенную молекулу MHC класса I, использованную при исходной иммунизации аллогенными опухолевыми клетками. Никакой продукции IL-2 не наблюдалось в ответе трансфектантов на стимуляторы мышей, нокаутированных по генам TAP и b2-микроглобулина. Таким образом, было окончательно показано, что распознавание молекул MHC аллогенных опухолей является прямым и зависимым от связанных с ними пептидов. Дальнейшее развитие этой работы связано с получением животных с трансгенным TCR, оценкой эффективности его селекции у мышей, экспрессирующих мутантные формы аллоантигена, к которому он специфичен, и его роли в предотвращении роста опухоли у трансгенных животных.Существующие методы терапии онкологических заболеваний зачастую сильно снижают эффективность иммунитета, вызывая аплазию костного мозга и нарушение формирования клеток иммунной системы. Ее восстановление может быть ускорено применением новых методов восстановительной терапии, в том числе, терапии цитокинами. В предыдущих исследованиях (Анфалова и др., 1989, 1995) было показано, что кортизонрезистентные тимоциты продуцируют фактор, вызывающий интенсивное формирование эндогенных колоний у сублетально облученных животных. В этих условиях для восстановления после лучевого поражения решающее значение имеет способность стволовых клеток мигрировать из костного мозга и репопулировать пораженные кроветворные органы. Для подтверждения предположения о том, что медиаторы кортизонрезистентных тимоцитов индуцируют миграцию стволовых элементов из костного мозга были поставлены эксперименты по неравномерному облучению. У мышей во время летального облучения экранировали участок бедренной кости, в котором сохранялись стволовые кроветворные элементы. Эти неповрежденные стволовые и коммитированные клетки могут восстановить гемопоэз после радиационного поражения. Введение супернатанта кортизонрезистентных тимоцитов приводило к значительному увеличению интенсивности образования колоний кроветворных клеток и продолжительности жизни сублетально облученных животных по сравнению с контролем. В экспериментах in vivo показано, что введение супернатанта кортизонрезистентных тимоцитов приводит также к увеличению скорости восстановления пула тимоцитов после сублетального облучения и восстановлению гуморального иммунного ответа на Т-зависимые антигены у бестимусных мышей nude. Сотрудниками лаборатории Т.В.Анфаловой и Л.М.Хромых проводится обширная работа по очистке и молекулярной идентификации фактора кортизонрезистентных тимоцитов. Дальнейшая разработка этой темы, идентификация и получение фактора в рекомбинантной форме могут привести к созданию эффективных препаратов, стимулирующих восстановление кроветворных тканей после облучения и восстановление ряда иммунных функций на фоне иммунодефицита.